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HAKATA 透析型胎牛血清 【產(chǎn)品特性】

1、內(nèi)毒素含量低，三次納米級(jí)過濾

2、嚴(yán)格控制批次差異

3、來源可靠、可溯源

4、每個(gè)批次提供相應(yīng)檢驗(yàn)檢疫報(bào)告

5、適合各種常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

6、干冰運(yùn)輸，建議存儲(chǔ)溫度為-20℃至-10℃

HAKATA 透析型胎牛血清 真正行貨通常作為補(bǔ)充成分添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)使用。它能夠提供各種大分子蛋白，小分子量營養(yǎng)，水溶性成分的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，和其它一些細(xì)胞在體外所必需的成分，如激素和附著因子。血清可以結(jié)合或中和一些生長因子中的有毒成分，并提供培養(yǎng)基的緩沖能力。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清的添加依賴于基礎(chǔ)培養(yǎng)基的化學(xué)組成，培養(yǎng)細(xì)胞的類型，及所用的培養(yǎng)系統(tǒng)。

我們?cè)谔峁┘?xì)胞培養(yǎng)基、平衡鹽溶液、無血清培養(yǎng)基和試劑的同時(shí)，還提供高品質(zhì)的血清。我們對(duì)血清制備進(jìn)行全過程監(jiān)管。從血清收集到zui終產(chǎn)品檢驗(yàn)和內(nèi)部稽核的每一個(gè)步驟，我們都采用設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，以確保整個(gè)過程中每個(gè)環(huán)節(jié)的產(chǎn)品質(zhì)量。對(duì)整個(gè)過程的控制可以保證產(chǎn)品的持續(xù)高品質(zhì)，降低不同批次的差異。

處理：全部血清：收集的血液均在冷藏條件下處理。血清和血分離后立即將血清合并并冷凍。只有符合我們的檢測標(biāo)準(zhǔn)的血清才被接受作進(jìn)一步處理。

熱滅活血清：熱滅活是在56℃水浴中嚴(yán)格控溫30分鐘。透析血清：用10,000截留分子量的透析膜在0.15M的NaCl中進(jìn)行透析，直到葡萄糖水平低于5mg/dl(用鄰甲苯胺測試法檢驗(yàn))。γ射線照射血清：可按客戶要求對(duì)血清進(jìn)行γ射線照射。通過γ射線照射以滅活各種動(dòng)物血清(包括胎牛血清、新生牛血清、豬血清和馬血清)中的病毒和支原體的方法已經(jīng)得到證實(shí)。研究證實(shí)照射劑量在30-45kGy為宜。血清在此照射后物理化學(xué)特性和細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)沒有變化。裝瓶：粗血清須通過一系列的過濾才成為成品。zui后的過濾步驟包括使用0.2um和0.1um的無菌過濾。胎牛血清須通過三次0.1um過濾，其他血清須通過0.2um過濾。zui終產(chǎn)品的質(zhì)量控制：我們采取以下方法對(duì)每一批次的產(chǎn)品選取一定數(shù)量的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制分析：

化學(xué)檢測：使用低溫凝固點(diǎn)的方法檢測滲透壓，以保證符合產(chǎn)品規(guī)范。我們每天使用國家標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)研究所標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)我們的滲透壓檢測儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。同樣每天使用國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。

使用電泳圖譜鑒定血清的整體性質(zhì)。樣品被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素基質(zhì)中，并在緩沖體系內(nèi)遷移。條帶經(jīng)染色、清潔、干燥后用密度儀進(jìn)行掃描，以檢測白蛋白和球蛋白組分的相對(duì)濃度。為證實(shí)是否在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行采血和處理，使用修飾的Fleming方法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行分光光度檢測。

隨著動(dòng)物年齡的增加，血清總蛋白含量也相應(yīng)地提高。使用自動(dòng)化的Biuret方法進(jìn)行總血清蛋白的檢測，以確認(rèn)動(dòng)物年齡并驗(yàn)證符合產(chǎn)品規(guī)范。使用色度計(jì)在不同波長下檢測樣品和Biuret試劑混合波的吸光度。自動(dòng)計(jì)算結(jié)果后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得到蛋白值(克/公升)。

穩(wěn)定性檢測程序：在每一個(gè)標(biāo)記為體外診斷的產(chǎn)品上顯示的效期表明了這個(gè)產(chǎn)品具有多長時(shí)間的效能。我們的穩(wěn)定性程序確定和證明了產(chǎn)品效期。我們定期監(jiān)測批量產(chǎn)品，確定產(chǎn)品在推薦貯存條件下具有可接受效果的時(shí)間長度。

微生物學(xué)檢測：所有血清使用Barile&Kern的大體積方法檢測支原體。在推薦方法的檢測范圍內(nèi)檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的。樣品至少應(yīng)該在肉湯中合并培養(yǎng)3個(gè)星期，同時(shí)要在瓊脂平板上進(jìn)行不少于4次傳代培養(yǎng)。在有氧和厭氧(95%氮，5%CO2)條件下，平板在36±2℃下孵育。在檢測過程中，每周對(duì)瓊脂平板進(jìn)行一次微生物生長情況檢驗(yàn)。使用Dienes染色法對(duì)懷疑被污染的瓊脂平板進(jìn)行支原體菌落的檢測。然后，對(duì)平板進(jìn)行再次鏡檢。對(duì)孵育肉湯瓶要定期進(jìn)行濁度和pH值變動(dòng)的檢測。在推薦方法檢測范圍內(nèi)，所有血清也要使用Hoechst熒光DNA染色法進(jìn)行不可在肉湯中培養(yǎng)的支原體(包括M.hyorhinis屬)檢測。

病毒檢測：已知無外來物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基須經(jīng)過在包含15%測試血清的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行為期21天的三次傳代培養(yǎng)。使用對(duì)照培養(yǎng)基和已知對(duì)外來物質(zhì)為陰性的血清平行地維持陰性對(duì)照培養(yǎng)。整個(gè)期間，檢測所有的培養(yǎng)情況，以便發(fā)現(xiàn)是否存在病毒誘發(fā)的細(xì)胞形態(tài)改變或致細(xì)胞病變效應(yīng)。在14至21天的培養(yǎng)期間，對(duì)含有檢測血清的平行培養(yǎng)瓶按下面標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測方法進(jìn)行評(píng)估。

將其中一瓶檢測細(xì)胞用胰蛋白酶消化，然后把細(xì)胞分別加入到總面積為6cm 2 的六室載玻片上。同時(shí)準(zhǔn)備陰性對(duì)照載玻片。在檢測培養(yǎng)的單室載玻片上加入牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛細(xì)小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸病毒的染色劑，作為單個(gè)的陽性對(duì)照。再經(jīng)過7天培養(yǎng)(總共21天)，利用熒光抗體技術(shù)檢測病毒。

通過對(duì)檢測培養(yǎng)進(jìn)行蘇木精伊紅染色，觀察致細(xì)胞突變效應(yīng)(CPE)或其他病毒誘導(dǎo)效應(yīng)。檢測細(xì)胞是否存在CPE效應(yīng)、內(nèi)含物、多核體或其他異常效應(yīng)。

內(nèi)毒素檢測：我們用阿米巴變形細(xì)胞溶解物(LAL)凝膠法來檢測胎牛血清的內(nèi)毒素含量。

效能檢測：
對(duì)每一批次的胎牛血清，我們都進(jìn)行下述培養(yǎng)效能檢測。選擇血清zui重要的標(biāo)準(zhǔn)是其支持特殊細(xì)胞的生長能力。因此，除了保證血清通過嚴(yán)格的品質(zhì)控制，我們也同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)血清的三個(gè)重要的培養(yǎng)效能進(jìn)行檢測：克隆效率、貼壁效果和二倍體成纖維細(xì)胞生長促進(jìn)。

克隆效率分析：克隆效率實(shí)驗(yàn)分析每一批胎牛血清促進(jìn)小鼠骨髓瘤細(xì)胞及其衍生的雜交瘤細(xì)胞的克隆和生長能力。下列產(chǎn)品
經(jīng)驗(yàn)證可用于該實(shí)驗(yàn)：
Sp2/0-Ag14(ATCC #CRL 1581)
P3x63-Ag8.653(ATCC #CRL 1580)

每一批胎牛血清都要分別在復(fù)制微量滴定平板上加入兩種血清濃度和兩種細(xì)胞接種量(10%血清和1cell/孔，4%血清和5cells/孔)的情況下進(jìn)行分析?？寺》治鼋Y(jié)果除以已確定的參照血清值得以歸一化。在許多日常雜交選擇程序中具有代表性的是高濃度的血清，而低濃度血清在設(shè)計(jì)血清批次細(xì)微差異放大檢測中有更為嚴(yán)格的測試。嚴(yán)格的1cell/孔測試是模擬單一雜交選擇的實(shí)驗(yàn)室條件。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報(bào)告中的克隆效率值為兩次測試條件下的平均值。

克隆分析法：克隆分析法是在復(fù)式96孔板中加入兩種胎牛血清濃度(10%v/v)和(4%v/v)和兩種接種量的情況下進(jìn)行的。每一次化驗(yàn)中，同時(shí)測量前期已驗(yàn)證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)。
克隆分析按下述方法進(jìn)行：

1．Sp2/0-Ag14(sp2)和P3x63-Ag8.653(653)在含有10%的胎牛血清的RPM1640中通常保持對(duì)數(shù)生長期。在顯微鏡下，利用臺(tái)盼藍(lán)排除法對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2．用RPM1640培養(yǎng)基將儲(chǔ)備細(xì)胞懸浮液進(jìn)行連續(xù)稀釋，使其達(dá)到預(yù)期的25cells/ml和5cells/ml接種濃度。準(zhǔn)備含有參照或測試胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基。將這種密度的細(xì)胞分配到各個(gè)分析生長培養(yǎng)基體積為0.2毫升的孔中，使其分別平均含有5個(gè)和1個(gè)細(xì)胞。

3．將96孔板放入36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養(yǎng)箱孵育約10至15天。

4．在孵育期間，用肉眼觀察平板并對(duì)用于克隆的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)。克隆效率按下列方法計(jì)算：克隆效率=(陽性孔平均數(shù)/孵育孔總數(shù))×100%

5．每一批次胎牛血清維持指示劑骨髓瘤細(xì)胞克隆效率的定量按照以下方法測得的相對(duì)克隆效率(RCE)進(jìn)行歸一化：RCE=檢測血清的克隆效率/對(duì)照血清的克隆效率貼壁效率分析：貼壁效率分析是利用已轉(zhuǎn)型的人類細(xì)胞系來檢測每一批血清促使持續(xù)貼附細(xì)胞系的生長能力。選擇已被驗(yàn)證可以檢測貼壁效率的細(xì)胞系A(chǔ)549(人肺腫瘤細(xì)胞，ATCC#CCL,185)，是因?yàn)樗梢詤^(qū)分一批血清維持細(xì)胞貼壁和繁殖能力的細(xì)微差異。

每一批次胎牛血清都要在兩種血清濃度和兩種細(xì)胞接種濃度下(10%血清和100cells/孔，4%血清和200cells/孔)測試三次。在36±2℃，4-6% CO 2 的潮濕培養(yǎng)箱孵育約10至14天，對(duì)被染色的細(xì)胞菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)即可得到其貼壁效率。將結(jié)果除以參考的對(duì)照血清得以歸一化。通過兩種血清濃度的測試，可以驗(yàn)證該批次血清在減量和標(biāo)準(zhǔn)水平下維持生長的能力。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報(bào)告中的貼壁效率值為兩次測試條件下的平均值。

貼壁分析法：使用貼附分析檢測上述每一批測試血清。這種分析法針對(duì)每一個(gè)血清樣品使用一個(gè)6孔板(每室9.6cm 2 )，并可以對(duì)三個(gè)孔的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均處理。每一次化驗(yàn)中，同時(shí)測量前期已驗(yàn)證合格的一批胎牛血清，并將此測量值作為內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)。

貼附分析按下述方法進(jìn)行：

1．A549細(xì)胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在36±2℃，以亞融合密度下進(jìn)行培養(yǎng)。

2．含10%(v/v)和4%(v/v)血清的DMEM由分別在22.5毫升和24毫升DMEM中加入2.5毫升和1毫升胎牛血清配制而成，zui終有效體積為25毫升。將5毫升含血清培養(yǎng)基分別加入6孔板的每一個(gè)孔中。

3．A549培養(yǎng)細(xì)胞先經(jīng)過胰蛋白酶消化，測定活細(xì)胞數(shù)，然后稀釋細(xì)胞懸浮液至2,000cells/ml。

4．將0.1毫升細(xì)胞懸浮液加入200cells/孔室中，0.05毫升懸浮液加入100cells/孔室中。平板混合后放入36±2℃，5%CO 2 的潮濕培養(yǎng)箱孵育約10至14天。

5．孵育后，取出平板，去除生長培養(yǎng)基，用亞甲基蘭-甲醇溶液對(duì)菌落進(jìn)行染色。

6．計(jì)算菌落形成，然后按下述方法計(jì)算貼壁效率：%貼壁效率=每孔菌落平均數(shù)/每孔孵育活細(xì)胞平均數(shù)×100

7．為方便比較，將測得的貼壁效率數(shù)值除以每批檢測血清的相對(duì)貼壁效率(RPE)得以歸一化：RCE=檢測血清的貼壁效率/參照血清的貼壁效率二倍體成纖維細(xì)胞生長：促進(jìn)生長分析用于檢測每一批胎牛血清維持難培養(yǎng)的人二倍體成纖維細(xì)胞長期生長的能力。

下列細(xì)胞系經(jīng)認(rèn)證可用于該實(shí)驗(yàn)：

WI-38(人二倍體肺成纖維細(xì)胞，ATCC#CCL 75)

WI-38細(xì)胞在含5%胎牛血清的低密度(2X10 5 /瓶)復(fù)式25-cm 2瓶中孵育，并進(jìn)行為期三個(gè)連續(xù)7天的傳代培養(yǎng)。在每一個(gè)培養(yǎng)期，細(xì)胞都從初始孵育密度開始傳代培養(yǎng)。壓力分層率、成倍繁殖數(shù)量和減量血清濃度是每批次促進(jìn)難培養(yǎng)二倍體細(xì)胞的生長血清的嚴(yán)格測試指標(biāo)。通過連續(xù)三代培養(yǎng)以減少前一次生長培養(yǎng)基的殘留影響，從而保證得到檢測批促進(jìn)生長能力的真實(shí)結(jié)果。為每一批次胎牛血清提供的分析證明報(bào)告為第三次傳代培養(yǎng)每復(fù)式培養(yǎng)瓶細(xì)胞數(shù)的平均值。將檢測值除以參考對(duì)照值得以歸一化。

二倍體成纖維細(xì)胞生長分析法：培養(yǎng)數(shù)代WI-38人類二倍體肺成纖維細(xì)胞，計(jì)算每一代的細(xì)胞總數(shù)。此項(xiàng)檢測所挑選出的胎牛血清批號(hào)能維持難以生長細(xì)胞、貼壁性細(xì)胞、正常的細(xì)胞株生長及存活。

1．準(zhǔn)備含5%檢測血清或已驗(yàn)證合格的參照血清生長培養(yǎng)基，基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基為含L-谷氨酰胺的HBME：EBME(1：1)。按要求，在每一次流量變化和分析過程中進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)需配制含5%血清生長的培養(yǎng)基。

2．在低代培養(yǎng)水平時(shí)，將2X10 5 WI-38細(xì)胞加入各個(gè)含9.5毫升生長培養(yǎng)基的復(fù)式25-cm 2 培養(yǎng)基中。在不擰緊瓶蓋的情況下，將培養(yǎng)瓶放入4-6%CO 2， 36℃±2℃環(huán)境中，保持24小時(shí)。然后擰緊瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在36℃±2℃下孵育7天，在第2天或第3天全部更換培養(yǎng)基。

3．在第7天，用胰蛋白酶對(duì)每一個(gè)含參照或檢測血清的復(fù)式瓶中的細(xì)胞進(jìn)行消化得到一定數(shù)量細(xì)胞，然后合并并計(jì)數(shù)。將2x10 5 WI-38細(xì)胞加入含有新鮮生長培養(yǎng)基(已加入了與上一代同一批次的參照或檢測胎牛血清)的新的復(fù)式25-cm 2 瓶中，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。按第2步所述，將培養(yǎng)瓶進(jìn)行平衡并孵育。

4．如上所述經(jīng)過三代連續(xù)分析，在每一代結(jié)束時(shí)計(jì)算每一批參照或檢測血清的每瓶細(xì)胞平均數(shù)。zui后一代培養(yǎng)的各批檢測血清實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)生長率(RGR)作為參照血清實(shí)驗(yàn)中獲得的細(xì)胞生長率分子：

%RGR=檢測血清實(shí)驗(yàn)中每瓶平均細(xì)胞數(shù)/參照血清實(shí)驗(yàn)中每瓶平均細(xì)胞數(shù)X100S f9細(xì)胞生長促進(jìn)分析。通過昆蟲分析可以保證您購買的胎牛血清批次可以維持S f9細(xì)胞的生長。收到產(chǎn)品后，您需要做的就是混勻血清，在56℃下熱滅活30分鐘。這種分析法也可以用于乳白蛋白水解產(chǎn)品、酵母和其它生長輔料作為原料的生物效能分析。該分析法的準(zhǔn)確性取決于是否用常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方案進(jìn)行培養(yǎng)。用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法測得的細(xì)胞活性至少不低于80%。

細(xì)胞生長分析法。

1．使用含10%檢測或參照熱滅活胎牛血清的已驗(yàn)證的Grace昆明培養(yǎng)基配制*檢測培養(yǎng)基。

2．將儲(chǔ)備Sf9細(xì)胞加入50毫升離心管中，在50Xg下離心5分鐘。然后將每支試管的沉淀物重新用含10%的檢測或參照熱滅活胎牛血清*培養(yǎng)基配制成懸浮液。

3．反試管顛倒幾次，然后每支試管倒出1毫升樣品。用臺(tái)盼藍(lán)染色排除進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4．如果活性≥80%，把試管再顛倒幾次并取出0.25毫升樣品。然后用Coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5．將細(xì)胞加入Erlenmeyer瓶中，使其zui終細(xì)胞濃度為2.75X10 5 cells/ml。孵育后，再一次進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以保證細(xì)胞密度為2.5X10 5 至3.0X10 5 cells/ml。

6．將培養(yǎng)瓶放到搖床上，在27℃±1℃、80-90rpm條件下孵育96小時(shí)。

7．從每一培養(yǎng)瓶中分別取出0.25毫升樣品，用Coulter計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)取出一定量的樣品進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

8．將檢測細(xì)胞密度與參照細(xì)胞密度相比即可得到相對(duì)細(xì)胞密度(RCN)。

噬菌體檢測:我們利用溶菌斑分析法來檢測是否存在噬菌體。從每一批血清中取具代表性的樣品加入胰蛋白酶磷酸瓊脂中，并在其加入含有噬菌體敏感的大腸桿菌懸浮液(C-3000或K-12)。然后，混合物會(huì)在胰蛋白酶磷酸瓊脂平板上分層，在36±2℃環(huán)境下孵育約24小時(shí)后，觀察平板上溶菌斑的形態(tài)。

生化特征檢測。