★CQ★細(xì)胞培養(yǎng)-消化要有個(gè)度

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★CQ★細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就細(xì)胞消化而言，多做、善于總結(jié)，就可以把細(xì)胞養(yǎng)的越來(lái)越好。

★CQ★絕大部分細(xì)胞消化只要用胰酶潤(rùn)洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無(wú)法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對(duì)細(xì)胞傷害很大。簡(jiǎn)單的程序是PBS潤(rùn)洗吸去，胰酶潤(rùn)洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細(xì)胞全部消化成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙壯移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了。

一般能移動(dòng)了，說(shuō)明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒(méi)有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細(xì)胞就是*成單個(gè)細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過(guò)程中仍然會(huì)聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要過(guò)幾個(gè)小時(shí)就拿出來(lái)吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來(lái)，即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過(guò)20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右）是正常的，不要再去延長(zhǎng)消化時(shí)間，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細(xì)胞：

潤(rùn)洗方法5min還不能消化，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細(xì)胞，胰酶消化，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過(guò)5min，即可見(jiàn)細(xì)胞成片移動(dòng)，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。

★CQ★常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤(rùn)洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝，對(duì)細(xì)胞代數(shù)，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個(gè)時(shí)候，胰酶消化，就是潤(rùn)洗，都會(huì)對(duì)細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來(lái)使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，胰酶切割細(xì)胞外基質(zhì)的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過(guò)螯合Ca離子，作用于整聯(lián)蛋白的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對(duì)付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理。一般不要試圖延長(zhǎng)消化時(shí)間（如果10min還消化不*的話），而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌，是常見(jiàn)的操作，因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍?。?duì)于一些難消化細(xì)胞，可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制胰酶的活性。但對(duì)于絕大部分細(xì)胞用胰酶或者EDTA溶液潤(rùn)洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液。

每段時(shí)間定期對(duì)細(xì)胞房、培養(yǎng)箱&水盤(pán)、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個(gè)角落細(xì)菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細(xì)胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時(shí)處理。